کلونینگ و بیان ژن لیپاز باسیلوس ترموکاتنولاتوس در اشریشیاکلی

لیپازها (تری اسیل گلیسرول اسیل هیدرولازها) هیدرولیز و ساخت استرهای تشکیل شده از گلیسرول و اسیدهای چرب دارای زنجیره های بلند را کاتالیز می کنند و در صنایع مختلف از قبیل صنایع غذایی، لبنی، شوینده، کاغذ سازی، چرم سازی، دارویی، کشاورزی و صنایع روغنی کاربرد دارند. در این تحقیق، کلونینگ و بیان ژن btl2 با توالی نشانه تاژک cs3 اشریشیاکلی انجام و با بیان ژن با توالی نشانه طبیعی مقایسه گردید. ژن btl2 از ژنوم باسیلوس ترموکاتنولاتوس توسط pcr جداسازی، کلون و با روش های استاندارد مهندسی ژنتیک تأیید شد. سپس با استفاده از آنزیم های ndei ، hindiii وsaci ژن مذکور از وکتور کلونینگ (ptz57r/t) جدا و مجدداً در وکتورهای بیانی pet21-a(+) و pet26-b(+)کلون و به e. coli سویه bl21(plyss) منتقل شد. بررسی پروتئین های سلولی بر روی ژل پلی آکریلامید (sds-page)، بیان شدن لیپاز حدوداً 42 کیلو دالتونی را تأیید و آنالیز پروتئینی و بررسی فعالیت لیپاز نوترکیب در مایع پری پلاسمی توسط آزمون pnpp حاکی از این بود که هر دو توالی نشانه قدرت پایینی برای ترشح پروتئین به فضای پری پلاسمی e. coli دارند، که یکی از دلایل آن را می توان بیان پروتئین به صورت اینکلوژن بادی مطرح کرد، بدین منظور مراحل خالص سازی و refolding بر روی اینکلوژن بادی انجام و با روش ph-stat و برادفورد به ترتیب فعالیت آنزیمی و میزان لیپاز محلول اندازه گیری شد.